Einer der bekanntesten Absolventen der Universität Erfurt war Martin Luther, der hier von 1501 bis 1505 studierte und seinen Magister der philosophischen Fakultät erhielt. In der Reformationszeit wandte sich die Stadt mehrheitlich dem evangelischen Bekenntnis zu. 1521 wurde mit Georg Petz der erste evangelische Pfarrer ernannt.[20] Der Rat zu Erfurt unterzeichnete die lutherische Konkordienformel von 1577.[21] Im Jahr 1597 wütete neben der Pest die Rote Ruhr in Erfurt, 7700 Menschen starben, darunter viele Professoren und Doktoren, fast 30 Magister und die meisten Studenten.[22]
Am 21. April 1618 kam es zu einem Vertrag zwischen dem Mainzer Erzbischof Johann Schweikhard von Cronberg und der Stadt Erfurt, der die schon früher zugestandene Religionsfreiheit bestätigte und sie ausdrücklich auf das Erfurter Landgebiet erweiterte. Zur rechtlichen Stellung der Stadt wurde festgelegt, dass sie Eigentum des Erzstifts Mainz sei und auf jegliche Reichsstandschaft verzichte. Der Dreißigjährige Krieg schädigte die Stadt schwer. Erfurt wurde von 1632 bis 1635 und von 1637 bis 1650 von den Schweden besetzt. Der Westfälische Friede brachte der Stadt nicht die erhoffte Reichsfreiheit. Dadurch wurden wieder jahrelange Auseinandersetzungen ausgelöst.
Kurmainzische Statthalterei, heute Thüringer Staatskanzlei
Gedenkmedaille, sogenannter Pesttaler aus Silber auf die Beendigung der letzten Erfurter Pestepidemie von 1683
Karte von Erfurt (um 1730)
1664 eroberten französische und Reichsexekutionstruppen des Mainzer Kurfürsten und Erzbischof Johann Philipp von Schönborn die Stadt. Damit wurde die kurmainzische Herrschaft wiederhergestellt. Erfurt wurde nun als Hauptstadt des Erfurter Staats zusammen mit dem Eichsfeld von einem Mainzer Statthalter regiert, der seinen Sitz in der Kurmainzischen Statthalterei (heutige Staatskanzlei) hatte. Um weiteren Aufständen vorzubeugen und als Schutz gegen die protestantischen Mächte ließ der kurmainzische Kurfürst und Erzbischof, Johann Philipp von Schönborn, auf dem Gelände des Petersberges eine Zitadelle errichten.
1682 und 1683 erlebte Erfurt die schlimmsten Pestjahre seiner Geschichte, allein 1683 erlag über die Hälfte der Bevölkerung der tödlichen Krankheit. Siehe dazu Pesttaler#Beschreibung des Schautalers (Medaille) von Erfurt.
In Erfurt sind Hexenverfolgungen von 1526 bis 1705 bekannt. Prozessakten liegen nur unvollständig vor. Zwanzig Menschen gerieten in Hexenprozesse, mindestens acht Menschen fanden den Tod.[23] 1705 wurde die 42-jährige Gänsehirtin Anna Martha Hausburg aus Mittelhausen gefoltert, enthauptet und dann verbrannt. Ihre siebenjährige Tochter Katharina Christina musste bei der Hinrichtung ihrer Mutter zusehen.[24]